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检测技术

发布:admin 发布时间:2017-11-21 来源:本站

 细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法

步骤一:亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白

1.
用细胞裂解液裂解细胞,10000rpm离心2分钟,取上清备用。
2.
20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388) PBS2次,每次1mL
3.
将细胞裂解上清液与洗好的填料(ICP0388)混匀,39oC旋转摇床低速孵育60分钟。
4.1000rpm
离心1分钟,去上清,用PBSt重悬沉淀,1000rpm离心1分钟,去上清,重复3次,最后一次用PBS洗,吸弃上清。
注:细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂,组蛋白乙酰化酶抑制剂等。

步骤二:释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白                                    
5.
20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟,10000rpm离心1分钟,将上清液体全部转移到含有80 μL0.2M Na2CO3ELISA薄板上,39oC孵育30分钟;
6.
取出ELISA薄板,拍干。用PBSt清洗2次,每次均需拍干。加入100 μL0.5%BSAPBSt 39 封闭10分钟。


步骤三:用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平

7.
取出ELISA薄板,拍干,用PBSt清洗2次,拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物(Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381),39 孵育30分钟。
8.
取出ELISA薄板,拍干,用PBSt清洗板孔3次,每次均需拍干。加入100 μLTMB液,39 孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4终止反应,在450nm波长下读数。